N15和C13標記重組蛋白的制備

隨著科學技術的發(fā)展，蛋白質結構學和蛋白質組織代謝學開始飛速的發(fā)展，特別是近些年NMR（nuclear magnetic resonance）技術在蛋白結構分析領域逐漸成熟，使蛋白質的結構分析變得簡單易行。 NMR分析蛋白結構的基本原理是利用核質譜儀發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N、C原子，使H、N、C這些原子從基態(tài)轉變成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當電磁波發(fā)射完畢后，激發(fā)態(tài)的原子會自動恢復到基態(tài)，多余的能量就釋放出去，通過收集這些能量信息，做進一步的分析便能得到蛋白的原子結構，畫出蛋白的三維結構圖。 NMR技術雖然操作簡單，但是需要組成蛋白的H、N、C原子具有共振性，H具有天然的共振性可以分析10KD以下的蛋白，常規(guī)蛋白中含有的N14和C12不具有共振性，需要采用他們的同位素來代替。N15和C13屬于穩(wěn)定同位素不具有放射性，是目前取代常規(guī)蛋白中N14和C12代替物，所以我們在做蛋白結構NMR分析過程中，zui為重要的方面還是在大量 N15和C13標記蛋白的獲得。

蛋白質獲得的方式有很多種，但是要獲取大量的目標蛋白，仍然需要通過重組蛋白生物合成途徑，一方面容易控制生產條件，另一方面目標蛋白的產量和質量能夠得到保障。重組蛋白的生物合成可以選擇原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)等，目標蛋白需要用N15和C13標記，這使得培養(yǎng)細菌和細胞的培養(yǎng)基中不能帶入額外的C源和N源。出于對操作方便性、實用經濟性、產量高低、技術難度等多方面考慮，重組蛋白的生物合成以原核表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)為主。原核表達系統(tǒng)中培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基常用M9葡萄糖礦物培養(yǎng)基，酵母表達系統(tǒng)中培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)基常用察氏(czapck)培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基C源即用C13的單糖或二糖，N源即用含N15的氯化銨或硝酸鈉等，培養(yǎng)條件簡單，產生的標記蛋白易純化。（簡易步驟如圖所示）