與其他結(jié)構(gòu)生物學家一樣，Eva Nogales趕上了好時機。這位美國加州大學伯克利分校的教員現(xiàn)在可以利用新工具，解決幾年前根本無法解答的細胞分子機制問題。

zui近，Nogales和同事、分子生物學家、CRISPR-Cas9的聯(lián)合發(fā)明人Jennifer Doudna的合作項目正是個好例子。她們都對R環(huán)十分感興趣。很多情況下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，細胞內(nèi)會形成一個由核苷酸構(gòu)成的R環(huán)。Nogales等人對化膿性鏈球菌中的R環(huán)進行了成像，得到了近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，提示了Cas9酶在特定位點如何打開DNA，并使其可用于CRISPR的分子剪刀。

這項工作zui突出的是科學家能快速地將功能與結(jié)構(gòu)起來，而且他們能把成像方法結(jié)合起來。一個多世紀以來，結(jié)構(gòu)生物學的方法一直是X射線晶體衍射法。但有些生物分子太大或太小，難以結(jié)晶，因此不能采用X射線法。而且，一些分子在發(fā)揮功能時，會發(fā)生形態(tài)或朝向的變化，而結(jié)晶法無法捕捉這些變化。

現(xiàn)在，科學家擁有一個龐大的成像工具庫。低溫電子顯微鏡或化學家的核磁共振（NMR）成像等方法，都能在不結(jié)晶的情況下，獲得接近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，從而揭示分子的形狀、大小和方向。但并非所有方法對活細胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)、核酸都有用。

經(jīng)驗證明，沒有一個單一的方法足以探討細胞中發(fā)生的動態(tài)行為和復雜的相互作用。的解決辦法是整合來自多個工具的圖像。

這種方法得到了諸多追隨者。斯坦福大學結(jié)構(gòu)生物學家Roger Kornberg指出，每個方法都能提供一些重要信息，結(jié)合起來，就能實現(xiàn)1+1>2的效果。由于在揭示基因轉(zhuǎn)錄機制方面的貢獻，Kornberg于2006獲得了諾貝爾化學獎。對于這一突破性研究，他使用的是X射線晶體衍射法?，F(xiàn)在，和其他晶體學家一樣，他開始使用多種方法的結(jié)合。

Kornberg繼續(xù)分析RNA聚合酶II，但現(xiàn)在他把冷凍電鏡和晶體學技術(shù)結(jié)合起來。與晶體技術(shù)相比，冷凍電鏡可用于不易結(jié)晶的生物分子，并且能解析較大的分子，但目前分辨率則稍遜*。Kornberg實驗室還使用化學交聯(lián)和質(zhì)譜法，揭示鄰近蛋白質(zhì)之間的關(guān)系以及利用已知蛋白質(zhì)信息進行同源性建模。

同時，Nogales和Doudna團隊也使用混合方法研究R環(huán)。Nogales表示，“高分辨率的X射線晶體法無法解析完整的R環(huán)結(jié)構(gòu)。”所以他們用冷凍電鏡在低分辨率上對完整的環(huán)結(jié)構(gòu)進行解析。只有把兩者結(jié)合起來，研究人員才能真正揭示CRISPR-Cas9中R環(huán)的作用。

這種混合或綜合性方法有助于研究人員深入研究基礎(chǔ)科學問題，對藥物也非常有用。細胞膜上的大蛋白質(zhì)往往是治療靶標，高分辨率混合方法能揭示藥物與受體相互作用的原子細節(jié)。同樣，通過展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原體的包膜蛋白與免疫細胞相互作用機制，能有助于疫苗發(fā)展。納什維爾范德堡大學結(jié)構(gòu)生物學家Jens Meiler表示，這些結(jié)構(gòu)對人們理解免疫系統(tǒng)的工作機制非常重要。

Noglaes總結(jié)到：“這是混合方法的黃金時代。”

夢想成真

德國歐洲分子生物學實驗室(EMBL)細胞生物和生物物理部主任Jan Ellenberg表示，這個時代對很多生命科學家來說，是夢想成真的時代。這個夢想是從原子層面無縫銜接到細胞層面。針對細胞大分子的深入理解自然能解答結(jié)構(gòu)生物學的首要問題：一個分子的結(jié)構(gòu)是怎么和其功能在一起的?

結(jié)構(gòu)生物學家工具箱中的每種技術(shù)都提供了不同的視角。生物學家相信，使用混合方法構(gòu)建的模型可以準確地反映分子或復合體在細胞中的行為。Meiler說：“你需要把這些技術(shù)結(jié)合起來，才能得到全面答案。”

X射線晶體衍射一直是確定蛋白質(zhì)原子結(jié)構(gòu)的標準方法。在成立于1971年的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行擁有的大約12萬個模型中，約有90%來自晶體學研究。

不過，對于結(jié)構(gòu)生物學家而言，該技術(shù)雖然分辨率高，但也有局限性。首先，樣品要高度純化，以產(chǎn)生有序的晶體。科學家通過分析原子如何散射光確定分子結(jié)構(gòu)。該技術(shù)需要有足夠的原子，以產(chǎn)生可測量的衍射圖案，并且每一個晶體必須是靜態(tài)的。因此，該方法不能揭示一個分子是如何運動的以及如何起作用的，也不能揭示它如何與其他系統(tǒng)互動。

德國復雜系統(tǒng)研究所計算結(jié)構(gòu)生物學小組組長Gunnar Schroder指出，蛋白質(zhì)不僅僅是一個單一的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，“通常情況下，你想看到的是整個蛋白質(zhì)如何工作”。Schroder使用混合方法理解蛋白的行為和彼此間的。晶體技術(shù)能提供蛋白在脫離正常環(huán)境時的快照。但結(jié)構(gòu)生物學家需要其他方法補充晶體結(jié)構(gòu)信息，并提高他們對蛋白質(zhì)形態(tài)和功能的理解。

此外，許多蛋白質(zhì)，例如細胞膜上的藥物靶點，是靈活而不穩(wěn)定的。為了讓這些蛋白質(zhì)形成晶體，研究人員經(jīng)常要在某種程度上改變它們。Meiler指出，改變樣本可能無法準確反映分子的原生態(tài)以及其在細胞內(nèi)的排布方式。他把實驗和計算方法結(jié)合，以便更好地理解分子結(jié)構(gòu)。“晶體法是很好的初始方法，但這個方法不足以提供功能方面的信息。”他說。