1, 先選擇好探針,然后設計引物使其盡可能的靠近于探針。

　　2, 擴增子的長度應不超過400bp,理想的*能在100-150bp內(nèi),擴增片斷約短,有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性

　　3, 保持GC含量在20%和80%之間,GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應,從而會導致擴增效率的降低,及在SG分析中非特異信號。

　　4, 為了保證效率和重復性,應避免重復的核苷酸序列,尤其是G(不能有4個連續(xù)的G)

　　5, 將引物和探針互相進行配對檢測,以避免二聚體和發(fā)卡結構的形成。

　　PCR試劑盒操作流程：

　　1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器 、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

　　2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。

　　3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

　　4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

　　5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),并單獨存放。

　　6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

　　7. 儀器 擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

　　8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

　　9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。